陳嘉杰、陳摯、孟長樂 （深圳大學(xué)）

雙諾獎(jiǎng)之約：光鑷技術(shù)和CRISPR基因編輯的融合

自從阿什金發(fā)明光鑷以來，光學(xué)操作技術(shù)已經(jīng)成為遠(yuǎn)程操作納米物質(zhì)的強(qiáng)大工具，并在2018年，因其對(duì)生物系統(tǒng)的開創(chuàng)性貢獻(xiàn)，被授予諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。經(jīng)典的光鑷主要依賴于光的動(dòng)量變換，因此需要高數(shù)值孔徑（NA）物鏡和高功率激光，但光的衍射也限制了操作精度。

幸運(yùn)的是，與納米等離子體光學(xué)、電場、或溫度場等領(lǐng)域的跨學(xué)科結(jié)合新技術(shù)已經(jīng)有效地解決了這些限制，為粒子分析和操縱提供了新的機(jī)會(huì)。其中，利用光熱效應(yīng)的光鑷“光熱鑷”，也可以在微米尺度范圍內(nèi)操縱納米粒子。與傳統(tǒng)的光鑷相比，光熱鑷技術(shù)需要較低的激光功率密度（10-100 μW/μm2），減少了對(duì)被操作的生物樣品的不利光學(xué)影響，并擴(kuò)展了可操控粒子范圍，使其成為生物檢測的一個(gè)極佳工具。

可操控從微米到納米尺度的生物顆粒，包括細(xì)菌和活細(xì)胞，單鏈和雙鏈DNA分子（ss-和dsDNA），以及蛋白質(zhì)（光學(xué)學(xué)報(bào), 2023, 43(14): 1400001）。然而，光鑷在液體介質(zhì)中仍不具有生物分子原位識(shí)別能力。

值得注意的是，聚類規(guī)則間隔短回文重復(fù)（CRISPR）系統(tǒng)在基因編輯領(lǐng)域取得了重大突破，并在2020年獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。它由一個(gè)CRISPR相關(guān)（Cas）核酸酶蛋白和一個(gè)目標(biāo)DNA序列互補(bǔ)的引導(dǎo)RNA（crRNA）組成。當(dāng)在一定的溫度條件下（~37℃）被匹配的目標(biāo)DNA（ssDNA或dsDNA）特異性激活時(shí)，可以觸發(fā)反式切割，作用于周圍單鏈DNA分子。其對(duì)于基因的“單堿基突變”具備極高的分辨能力，已被廣泛應(yīng)用于生物檢測領(lǐng)域。然而，該類方法的靈敏度往往受到復(fù)雜樣本中目標(biāo)DNA的低豐度的限制。

所以，納米“光熱鑷”作為一種新興的創(chuàng)新技術(shù)，在納米顆粒的原位操作領(lǐng)域應(yīng)用很廣，但對(duì)于生物分子特異性識(shí)別的技術(shù)尚不完善，尤其在單核苷酸多態(tài)性（SNP）的精確檢測方面的不足，阻礙了其在單分子檢測與治療領(lǐng)域的突破。能否發(fā)明一種新型的檢測技術(shù)，既能彌補(bǔ)CRISPR生物傳感的不足，又能上光鑷具備生物分子識(shí)別的能力呢？

答案是肯定的，近日，來自深圳大學(xué)物理與光電工程學(xué)院，光電子器件與系統(tǒng)教育部/廣東省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生物光子學(xué)研究中心陳嘉杰特聘研究員、邵永紅教授、張晗教授與香港中文大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系何浩培教授的研究團(tuán)隊(duì)首次將“光熱鑷”技術(shù)與CRISPR基因編輯技術(shù)進(jìn)行了融合。基于CRISPR基因編輯技術(shù)中的單堿基特異性識(shí)別能力，以及光熱鑷技術(shù)對(duì)生物分子的精準(zhǔn)操控，開發(fā)了一種新型生物檢測技術(shù)，即CRISPR增強(qiáng)的納米光熱鑷（CRONT）。

該成果以“CRISPR-powered optothermal nanotweezers: Diverse bio-nanoparticle manipulation and single nucleotide identification”為題發(fā)表在Light: Science & Applications。

具體來說，如圖1所示，通過在光熱激發(fā)下利用基底附近的擴(kuò)散泳和熱滲透流動(dòng)，成功地捕獲并富集三種納米粒子，包括金納米顆粒團(tuán)簇、CRISPR相關(guān)蛋白、以及目標(biāo)DNA，在SNP位點(diǎn)的檢測過程中，利用暗場成像技術(shù)實(shí)時(shí)監(jiān)測到光斑中心處CRISPR反式切割的動(dòng)態(tài)過程。

這種創(chuàng)新的方法賦予了光鑷技術(shù)前所未有的DNA識(shí)別能力。由于其對(duì)原位生物納米顆粒操作和鑒定的高特異性和可行性，它將有望成為護(hù)理點(diǎn)診斷、生物光子學(xué)和生物納米技術(shù)的通用工具。

圖1：CRONT工作原理

CRONT可以實(shí)現(xiàn)生物納米顆粒操作，并滿足目標(biāo)生物顆粒識(shí)別的CRISPR工作條件。具體而言，首先，我們成功地捕獲了ssDNA、dsDNA、BSA、Cas12a蛋白和DNA@金納米顆粒偶聯(lián)物。并對(duì)其捕獲剛度以及溫度場分布做了系統(tǒng)性研究。

其次，如圖2所示，通過結(jié)合基于CRISPR的DNA生物傳感方案，在捕獲光斑附近，通過監(jiān)測單個(gè)捕獲的DNA@金納米顆粒偶聯(lián)物被切割的概率，可用于原位DNA分子（SARS-CoV-2或猴痘）鑒定。并在無需核酸預(yù)擴(kuò)增的前提下，達(dá)到了25 aM（ssDNA）和250 aM（dsDNA）的檢測限。

圖2：CRONT對(duì)于超低濃度單/雙鏈DNA的檢測

更令人振奮的是，實(shí)驗(yàn)表明這種納米“光熱鑷”在超低的檢測量（10 μL）下，仍具有單核苷酸多態(tài)性（SNPs）的識(shí)別能力，這在遺傳多樣性檢測中起著至關(guān)重要的作用，并與各種表型性狀相關(guān)，包括疾病易感性和藥物反應(yīng)。因此，這種SNP檢測技術(shù)的創(chuàng)新亦可滿足未來基因組研究和醫(yī)學(xué)的多樣性需求。

未來展望

CRONT技術(shù)通過聯(lián)合CRISPR生物傳感系統(tǒng)以及“光熱鑷”技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了在超低的檢測限內(nèi)快速檢測SNP位點(diǎn)的功能，未來有望應(yīng)用于單分子水平的基因檢測以及基因編輯的應(yīng)用。我們相信，這種非接觸性的納米探針將解決更多的光學(xué)、熱學(xué)、生物學(xué)的共性問題，并在單粒子水平上，深化人類對(duì)多種復(fù)雜生物過程的理解。

論文信息

Chen, J., Chen, Z., Meng, C. et al. CRISPR-powered optothermal nanotweezers: Diverse bio-nanoparticle manipulation and single nucleotide identification. Light Sci Appl 12, 273 (2023). 

https://doi.org/10.1038/s41377-023-01326-9

閱讀原文